Газоплазменная коагуляция печени в эксперименте.
Голубев А.А.1, Доманин А.А.2, Кулаков П.А.1, Ситкин С.И. 3, Артемов В.В.4, Зуева В.А.1, Шепель Е.В.1
ГБОУ ВПО Тверская ГМА Минздравсоцразвития России
1Кафедра госпитальной хирургии с курсом урологии
2Кафедра патологической анатомии
3 Кафедра анестезиологии и реаниматологии
4ООО «ЭФА-медика», г. Санкт-Петербург
Введение: Современная хирургия паренхиматозных органов невозможна без качественного гемостаза. Для улучшения результатов резекций печени всё шире используются новые, прогрессивные технологии [1,2]. Особое место среди них занимают физические способы диссекции и коагуляции [3,4,5]. К настоящему времени в арсенале хирургов имеется довольно много аппаратов и установок, способных рассекать или коагулировать ткани при помощи различных видов энергии [6,7,8]. Однако, несмотря на большое число физических способов диссекции и коагуляции, до сих пор не существует строго аргументированных представлений относительно их оптимального использования при операциях на паренхиматозных органах [1,9].
На сегодняшний момент одним из самых распространенных способов хирургического гемостаза является высокочастотная электрокоагуляция, которую можно разделить на контактную (моно и биполярную коагуляцию) и бесконтактную [3].
Однако, научно обоснованный выбор режимов электрокоагуляции и улучшение качества гемо-, лимфо- и холестатического эффекта остается важной проблемой.
Метод аргоноплазменной коагуляции применяется в открытой хирургии, эндоскопической хирургии, лапароскопии и торакоскопии с 90-х годов прошлого столетия [3,5,10,11], в первую очередь для остановки обширных паренхиматозных кровотечений. При этом желаемый эффект достигается благодаря термическому воздействию энергии потока ионизированной аргоновой плазмы. В отличие от классической бесконтактной спрей-коагуляции электрическая высокочастотная дуга проходит к тканям через поток инертного газа. Длина и мощность дуги при спрэй-коагуляции может значительно варьироваться, что приводит к бесконтрольному эффекту гемостаза и неоднородности струпа. Факел инертного газа при газоплазменной коагуляции (ГПК) позволяет легко контролировать обрабатываемый участок. Поток газа образует конусообразный искровой промежуток, препятствующий бесконтрольному образованию электрической дуги. Ее длина и мощность остаются постоянными, что обеспечивает хороший гемостатический эффект. Заживление раневых поверхностей происходит быстрее, чем при контактном воздействии. Кровь и другие жидкости, которые могут повлиять на результат коагуляции, при использовании ГПК выдуваются из операционного поля. Это позволяет осуществлять наилучший контроль за обработкой раневой поверхности. Поток плазмы также снижает концентрацию кислорода на участке ткани подвергаемому электрохирургическому воздействию, что позволяет избежать карбонизации ткани [3,5,9].
Для корректного обсуждения процессов ГПК, следует обозначить, следующие основные понятия: способ возбуждения рабочего тела – вид сигнала, подаваемый от высокочастотного генератора (ВЧГ); рабочее тело – струя инертного газа, подлежащая ионизации, направленная на ткань, которая подвергается коагуляционному воздействию.
Цель: Поиск оптимального режима электрохирургического воздействия на печень для достижения наилучшего гемо- и холестаза при минимальных повреждениях подлежащих тканей.
Задачи:
1. Выбрать оптимальный способ возбуждения рабочего тела.
2. Экспериментально оценить возможности гемо- и холестаза при применении криптоноплазменной коагуляции (КПК).
3. Сравнить результаты воздействия на паренхиму печени ГПК при использовании криптона и аргона в качестве рабочего тела.
4. Оценить работоспособность оригинального экспериментального электрохирургического комплекса.
Материал и методы:
Специально под поставленные задачи фирмой ООО «ЭФА медика» был разработан оригинальный экспериментальный электрохирургический комплекс, состоящий из:
1. Генератора сигналов длительностью 1 мкс и частотой повторов от 15 до 48 кГц с напряжением холостого хода до 3 кВ с функцией переключения полярности и стабилизацией средней мощности.
2. Блок газоподачи, стабилизирующий объемный расход инертного газа в диапазоне от 0,5 до 8 л/минуту.
3. Блок регистрации выходного сигнала и электрических характеристик тканей (сопротивление, подводимая мощность, подводимое напряжение) в режиме реального времени.
4. Набор инструментов для контактной и бесконтактной коагуляции.
Характеристики комплекса полностью соответствовали ГОСТ Р 50 267.092 и ГОСТ Р 50 267.292.
Работа проводилась в два этапа. На первом – были проведены предварительные эксперименты с различной формой сигнала при одинаково подводимой электрической мощности и применением различного рабочего тела (аргон, криптон) на препаратах свиной печени.
На втором этапе, хронический эксперимент проводился на лабораторных животных – 10 поросятах одной породы, женского пола массой от 9 до 10 кг. В условиях нижнегрудной эпидуральной анестезии и седации фенозепамом в экспериментальной операционной выполнялась верхнесрединная лапаротомия. На печени, в области ее края, стандартизированным цилиндрическим инструментом диаметром 10 мм наносились 10 одинаковых повреждений, которые в последствии подверглись КПК и аргоноплазменной коагуляции (АПК) до достижения полного гемо- и холестаза.
Для гистологического исследования материал забирался с помощью стандартизированного цилиндрического инструмента диаметром 15 мм в момент операции и при проведении релапаротомии на 1-е, 3-е, 7-е 14-е и 30-е сутки. Фрагменты тканей фиксировали в 10% забуференном растворе нейтрального формалина. После фиксации материал обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Были изготовлены гистотопографические срезы толщиной 3-5 мкм. Для проведения патоморфологического исследования использовали обзорные (рутинные) методики: гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону. Применялись наиболее перспективные гистохимические методы для изучения клеточных и межклеточных компонентов соединительной ткани, сосудов и нервов, особенностей ангио- и фибриллогенеза. Способы гистохимического проявления гликозаминоглаканов: ШИК-реакция, окраска альциановым и толуидиновым синим, по Маллори-Мартинсу. Высокомолекулярные сульфатированные субстанции окрашивали орсеином по методике Шикато. На ДНК по методу Фельгена и на гликоген по Шабадашу. Проводили иммуногистохимические исследования с маркерами: CD-68 на активированные моноциты и макрофаги, CD-3 и CD-20 на Т и В клетки, CD-34 для выявления эндотелия сосудов. В качестве системы визуализации использовали наборы LSAB-2 (DAKO). Проводилось морфостатистическое исследование клеточного состава демаркационного воспалительного инфильтрата и ангиогенеза. Исследование проводилось на микроскопе Olimpus CX-41, цифровой фотокамере Olimpus C5060-«ADU» и персональном компьютере. Результаты морфологических исследований обработаны с помощью пакета статистического анализа.
Полученные результаты и обсуждение:
Выбор вида сигнала.
В ходе экспериментального выбора вида сигнала, возбуждающего рабочее тело, применялись два инертных газа аргон и криптон, полученные результаты были однотипны.
При выборе параметров электрического сигнала в первую очередь нам было необходимо достичь отсутствия в спектре сигнала низкочастотных компонентов и постоянной составляющей, так как постоянный ток приводит к электролитической диссоциации, а низкочастотный — к нервно-мышечным сокращениям.
Вторым требованием являлась возможность получения малых мощностей при сравнительно высоком напряжении, которое необходимо для получения плазменных шнуров.
В нашем случае факел плазмы образовывался в результате воздействия последовательности искровых разрядов на струю инертного газа. Направление разряда совпадало с направлением потока газа. Так как плазма представляет собой смесь ионов и электронов в состоянии динамического равновесия, нами рассматривались три варианта сигналов:
1. Последовательность импульсов положительной полярности.
2. Последовательность импульсов отрицательной полярности.
3. Последовательность симметричных импульсов.
а)
б)
в)
Рис. 1. Осциллограмма импульсов возбуждения. Цена деления по горизонтали – 500 нс, цена деления по вертикали 0,5 кВ.
Таким образом, при возбуждении плазмы импульсами положительной полярности (Рис. 1а) к тканям направлялись ионы, а электроны оттягивались электрическим полем обратно к инструменту. В случае отрицательных импульсов (Рис. 1б) ткань подвергалась воздействию свободных электронов плазмы. А при применении симметричного импульса (Рис. 1в) в первом полупериоде ткань бомбардировалась ионами инертного газа, а во втором электронами.
В ходе сравнения характера воздействия различных сигналов, электрические параметры (длительность импульса, напряжение, частота повторений, средняя мощность) и объемный расход газа сохранялся постоянным.
При использовании отрицательных импульсов, рабочее тело возбуждалось стабильно. Наблюдалось образование грубого струпа со значительным потемнением поверхности ткани, сопровождающееся интенсивным дымообразованием с резким органическим запахом, отличающимся от запаха, характерного для карбонизации ткани. При этом в зоне коагуляции отсутствовал кислород, необходимый для процесса карбонизации. Мы полагаем, что наблюдаемый процесс представлял собой деструкцию органических тканей электронами плазмы, так как именно они направляются к ткани при таком виде сигнала. Это способ был сочтен неприемлемым для применения, так как вместо желаемого эффекта коагуляции тканей и образования полимерных связей струпа обеспечивающего гемостаз, мы получаем разрушение органических молекул и возгонку их составляющих в окружающее пространство. Причем эти фрагменты имеют незакрытые (как в случае окисления) связи, что делает их токсичными, а возможно и канцерогенными.
При использовании импульсов положительной полярности, возбуждение потока плазмы так же оставалось стабильным, но струп был существенно мягче, дым отсутствовал. При макроскопической оценке характера коагуляционного струпа, данный вид сигнала является оптимальным для практического применения.
При использовании симметричного импульса требовалось существенно большее напряжение для возбуждения рабочего тела, факел плазмы отличался неустойчивостью, и его размер был минимален. Это делает процесс коагуляции некомфортным в применении. Глубина поражения ткани была существенно больше, чем в случае положительного импульса. Данный способ возбуждения мы тоже сочли непригодным.
Выбор рабочего тела.
В ходе экспериментов на препаратах свиной печени в качестве рабочего тела параллельно с аргоном был впервые применен криптон. Экспериментально доказано, что при использовании положительного сигнала данный газ ионизируется и поддерживает стойкий факел плазмы, а следовательно может быть использован в качестве рабочего тела при газоплазменной коагуляции, что также может быть подтверждено сравнением характеристик инертных газов (Таб.1).
Таб.1 Характеристика инертных газов
|
Рабочее тело |
Атомная масса |
Энергия ионизации |
Стоимость |
|
|
(эВ) |
(руб./л) |
|
|
Ar |
39,95 |
15,75 |
1 |
|
Kr |
83,8 |
13,99 |
100 |
|
Хе |
131,29 |
12 |
1000 |
Аргон, как инертный газ, широко применяется в медицине и промышленности длительное время. Криптон был выбран рабочим телом в связи со следующими параметрами:
1. Относится к инертным газам.
2. Обладает большей атомной массой, следовательно, и большей
массой иона.
3. Имеет меньшую энергию ионизации.
4. Относительная доступность в сравнении со следующими газами
данной группы.
При микроскопическом исследовании ткани печени из зоны раневой поверхности, подверженной электрохирургическому воздействию в двух режимах ГПК, усиленной аргоном и криптоном, во всех экспериментальных наблюдениях выявили однотипную тканевую реакцию. Через 30 минут после электрохирургического воздействия в области дна раны обнаружены скопления деформированных пикноморфных клеток, разделенных между собой полостями различного размера. Встречались участки бесструктурного оксифильного уплотненного некротического детрита.
Вместе с тем, толщина зоны указанных изменений существенно разнилась (рис. 2) и зависела от вида использованного инертного газа: аргон – 2,2±0,3 мм, криптон – 0,6±0,1 мм. При использовании аргона, встречались мелкие очаги дегидратированных обуглившихся структур, как проявления прямого коагуляционного некроза. Все виды некробиотических и некротических изменений были слабо отграничены от сохранившейся ткани печени узкой зоной лейкоцитарной демаркации. Инфильтрат, отделяющий некротизированные ткани, состоял из редко расположенных полиморфноядерных лейкоцитов, объемная плотность которых при морфологическом исследовании составила при АПК 12,3±1,9, при КПК 6,1±1,1 соответственно.
На границе прямого термического некроза и сохранившейся ткани печени были видны очаговые, преимущественно перикапилярные диапедезные кровоизлияния. Раневая поверхность при обоих видах воздействия на значительной площади была покрыта тонким струпом, состоявшим из эритроцитов, лейкоцитов и десквамированных гепатоцитов. Его толщина варьировалась в пределах 2,1±0,3 мм при АПК и 0,2±0,02 мм при КПК соответственно.
а) 
б) 
Рис. 2. а – компактная равномерная зона поверхностного коагуляционного некроза при КПК, б – глубокий фрагментированный участок поверхностного некроза при АПК. Окраска гематоксилином и эозином. Х 200.
Следует добавить, что при использовании АПК, в подлежащих участках печеночной ткани на глубине 2-4 печеночных долек от раневой поверхности отмечена эктазия печеночных вен, явления гидропической дистрофии паренхимы, умеренный отек соединительно-тканных прослоек и периферические диапидезные кровоизлияния (рис. 3). При использовании КПК эти изменения отсутствовали или были незначительными.
В просвете отдельных сосудов, прилежащих к зоне некротических изменений, отмечены явления стаза эритроцитов и даже обтурирующие фибриновые и смешанные тромбы. Кроме того, выявлена дегрануляция тканевых базофилов, периваскулярный отек, разволокнение и набухание фибриллярных структур. Встречались мелкие очаги кровоизлияний.
а) 
б) 
Рис. 3 Глубокие отечно-геморрагические изменения в подлежащих тканевых структурах дна раны при АПК, окраска гематоксилином и эозином, а – х100, б – х200.
Состав демаркационного инфильтрата менялся уже через сутки. При микроскопическом исследовании некротический струп, сформированный на поверхности раны, сохранял характерную для него структуру, описанную выше. По-прежнему он был представлен слоем резко деформированных пикноморфных клеток, полостями различного диаметра, некротизированными тканевыми фрагментами. Под струпом, в отдельных участках, отмечен тонкий слой фибринозного выпота, отличавшийся выраженной ШИК-позитивной реакцией. Полиморфноядерные лейкоциты отделяли зону некроза от сохранившейся ткани печени. Часть лейкоцитов отличалась признаками кариорексиса. Объемная плотность лейкоцитов на границе зоны некроза составила 18,3±1,6 при КПК и 47,6±2,3 при АПК соответственно.
Кроме того, при использовании АПК, уже через сутки в зоне демаркации появились моноциты и макрофаги. За лейкоцитарным инфильтратом сохранялась зона вторичных дисциркуляторных изменений, которую, с нашей точки зрения, необходимо расценивать как своеобразную зону резерва некроза. Ее толщина не менялась через сутки после воздействия, вместе с тем, граница вторичных изменений с подлежащими жизнеспособными гепатоцитами была выражена более отчетливо.
Спустя трое суток после газоплазменного воздействия в обоих случаях, зона первичного некроза оставалась без изменений.
Из зоны демаркационного инфильтрата лейкоциты по множественным щелям и стромальным прослойкам проникали в зону резерва некроза и некробиотических изменений. Среди лейкоцитов было отмечено обилие фигур кариорексиса. Демаркационный инфильтрат отличался клеточным полиморфизмом за счет присутствия моноцитов, фибробластов.
За счет этого объемная плотность полиморфноядерных лейкоцитов уменьшилась вдвое через 72 часа, независимо от вида воздействия. Изменение качественного состава клеток инфильтрата на поле демаркационного воспаления указывало на то, что воспалительная реакция вступила в свою макрофагальную фазу с начальными признаками активации пролиферативных изменений и ангиогенеза. Добавим, что в капиллярах и венулах, набухание эндотелиоцитов сопровождалось их пролиферативными изменениями. В отдельных полях зрения отмечено образование своеобразных «капиллярных почек» после воздействия КПК.
Через семь дней при микроскопическом исследовании суммарная зона некротических изменений увеличилась и уплотнилась за счет слияния зоны первичного некроза и зоны резерва некроза, независимо от вида газо-плазменного воздействия. И составила при использовании КПК 1,4±0,2 мм и 6,4±0,4 мм при АПК соответственно.
На данном экспериментальном сроке некротические изменения были отграничены от зоны жизнеспособных гепатоцитов формирующейся молодой грануляционной тканью, которая была представлена хаотичным разрастанием гемокапилляров и клетками гистеогенного и гематогенного происхождения. При этом пораженная ткань приобретала черты круглоклеточного инфильтрата, в котором преобладали макрофаги, лимфоциты, плазмоциты, молодые фибробласты, единичные клетки Мотта. Процесс сопровождался активным фибриллогенезом, синтезом коллагена и протеогликанов матрикса. На поле воспаления появились многочисленные гигантские многоядерные клетки, имеющие макрофагальное происхождение и образующиеся в результате слияния эпителиоидно-клеточных элементов.
В отдельных полях зрения демаркационное воспаление приобретало черты гранулематозного, а плотность инфильтрата была более выраженой при применении АПК. По-прежнему сохранялись диапедезные кровоизлияния разной давности, отложения гемосидерина.
На данном экспериментальном сроке не представлялось возможным морфологически типировать гигантские клетки как клетки типа «инородных тел» или как клетки типа Лангханса, поскольку не было четких закономерностей распределения ядер в цитоплазме таких элементов.
В отдельных полях зрения молодая грануляционная ткань приобретала морфологические черты молодой рубцовой ткани за счет направленного фибриллогенеза и продольного направления пучков молодых коллагеновых волокон. Ориентирование фибробластов в рубце совпадало с пучками коллагеновых волокон. Объемная плотность капилляров на данном экспериментальном сроке при АПК и КПК составила 3,9±0,3 и 2,2±0,4 соответственно.
Отмечены многочисленные контакты фибробластов с лимфоцитами за счет погружения последних в «седловидную» инвагинацию фибробласта (эффект активирования фибробласта и усиленного синтеза коллагена).
Среди активированных фибробластов отмечены нормальные фигуры кариокинеза. Участки формирования молодой волокнистой рубцовой ткани не имели признаков ремоделирования рубца.
На 14 сутки струп, покрывающий рану, был сильно фрагментирован, вокруг его отдельных элементов формировались очаги гранулематозного воспаления. В гранулемах сохранялось значительное количество многоядерных гигантских клеток макрофагального ряда (рис. 4), количество которых при АПК кратно превышало количество аналогичных элементов при воздействии КПК (27,6±2,1 и 10,3±1,7 соответственно). Такие модифицированные макрофаги активно участвовали в резорбции мумифицированных элементов в зоне некроза, обугленных частиц, гемосидерина и т.д. Объемная плотность грануляционной ткани и ее зрелость усиливались, сохранялось обилие контактов фибробластов и лимфоцитов, при которых последние приобретали новые морфологические особенности: компактное гиперхромное ядро и узкую просветленную цитоплазму.
Грануляционная ткань выглядела более зрелой за счет образованных гемокапилляров, значительная часть которых находилась в спавшемся состоянии и имела вид фиброзно-клеточных тяжей, лишенных просвета.
Фактически объемная плотность действующих капилляров по сравнению с 7 днем наблюдения при АПК сократилось вдвое, а при КПК втрое, и составила 2,1±0,5 и 0,8±0,3 соответственно.
а) 
б) 
Рис. 4. Гранулематозная макрофагальная тканевая реакция в зоне демаркации струпа, обилие гигантских клеток: а – при КПК; б – при АПК; х 200. 14-е сутки после воздействия. Окраска гематоксилином и эозином.
На 30 сутки продолжало меняться количественное отношение клеток инфильтрата: уменьшение числа макрофагов сопровождалось выраженным ростом объемной плотности лимфоцитов и фибробластов, среди последних увеличивались в объеме пучки коллагеновых волокон, которые обладали выраженной ШИК-позитивной реакцией, а по Маллори-Мартинсу окрашивались в голубой цвет. Поверхность зоны газоплазменного воздействия была покрыта сформированной нежной рубцовой тканью различной толщины: при АПК 3,4±0,8 мм, при КПК 0,9±0,2мм. Следует добавить, что при использовании криптона рубец отличался отчетливыми признаками зрелости и ремоделирования (Рис. 5).
а) 
б) 
Рис.5 картина рубцовой ткани после ГПК: а – при КПК; б – при АПК; х 100. 30-е сутки после воздействия. Окраска гематоксилином и эозином.
Выводы:
1. Оптимальным способом возбуждения рабочего тела является положительный сигнал, обеспечивающий стабильное состояние потока плазмы в струе, равномерность воздействия на коагулируемую поверхность, отсутствие задымления.
2. Криптон может быть использован в качестве рабочего тела при газоплазменной коагуляции.
3. Отмечается значительное ускорение течения раневого процесса и регенерации с формированием более нежного ремоделированного рубца при использовании криптоноплазменной коагуляции.
4. Разработанный электрохирургический комплекс может быть допущен к клиническим испытаниям.
Список литературы:
1. Тимербулатов В.М., Плечев В.В., Хасанов А.Г. Современные методы рассечения и коагуляции тканей в хирургии органов брюшной полости - М.: МЕДпресс-информ, 2007. - 174 с.
2. Schneider P.D. Liver resection and laser hyperthermia // Surg. Clin. North. Am. - 1992. - Jun 72(3) . - Р. 623-629.
3. Майстренко Н.А., ЮшкинА.С., Курыгин А.А. Физические способы диссекции и коагуляции тканей в абдоминальной хирургии. СПб.: Наука, 2004. 115 с.
4.Неворотин А.И. Введение в лазерную хирургию. - СПб.: СпецЛит, 2000. - 174 с.
5.Юшкин А.С. Майстренко Н.А., Андреев А.Л. Физические способы диссекции и коагуляции в хирургии // Хирургия. - 2003. - № 1. - C. 48-53.
6.Плетнёв С.Д. Лазеры в клинической медицине. - М.: Медицина, 1996. - 428 с.
7. Пряхин А.Н. Высокоинтенсивное лазерное излучение в лапароскопической гепатобилиарной хирургии // Анналы хирургической гепатологии. - 2006. - Т. 11, № 4. - С. 38-43.
8. Roggan A. Experimental study and first clinical results with a cooled application system for interstitial laser coagulation (LITT) / A. Roggan, V. Knappe, M.G. Mack // Proc. SPIE. - 1998. - Vol. 3249. - P. 85-93.
9. Weber J.C. New technique for liver resection using heat coagulative necrosis / J.C. Weber, G. Navarra, L.R. Jiao, J.P. Nicholls // Annals of surgery. - 2002. - Vol. 236, № 5. - P. 560-563.
10. Farin G., Grund K.E. Technology of argon plasma coagulation, with particular regard to endoscopic application // Endosc. Surg. – 1994. – Vol. 2. – P. 71–77.
11. Farin G., Grund K.E., Storek D. Endoscopic argon plasma coagulation, first clinical experience in flexible endoscopy // Endosc. Surg. – 1994. – Vol. 2. – P. 42–46.